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RPA技术在艾滋病检测中大展身手

来源:生物通    时间:2014年11月24日    点击数:    5星

重组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA扩增的速度非常快,灵敏度高,对硬件设备要求低,而且不需要复杂的样本处理。这样的技术特别适合于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

在艾滋病诊治中,即时检测是非常重要的,对婴儿来说更是如此。有案例显示,艾滋病毒(HIV)感染后立刻进行治疗就能控制住患者体内的病毒,让它们无法进行复制。举例来说,生来就携带HIV的密西西比婴儿,在出生后立即得到了治疗。后来这个孩子停药了两年多,病毒复制依然得到了控制。

目前婴儿艾滋病诊断的金标方法是DNA PCR,但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下,RPA技术正好可以大展身手。

纸做的HIV DNA检测装置

2012年九月,研究人员开发了一个由纸、玻璃纤维和塑料制成的装置,用来对HIV的DNA进行RPA扩增。这个装置成本低、小巧轻便、而且易于使用,只需五步就能搞定HIV检测。扩增结果可以通过侧流层析试纸来读取。

人们可以先从婴儿的干血斑样本中提取DNA,然后再进行RPA扩增。研究显示,用这个装置进行RPA扩增反应,能在十五分钟内将10拷贝的HIV DNA扩增到可检出的水平。可见,这是一个前景广阔的低成本即时检测装置。(文献:A paper & plastic device to perform recombinase polymerase amplification of HIV DNA, Lab on a Chip)

RPA检测HIV DNA的实战效果

如果不能及时检测婴儿体内的HIV-1,就会延误治疗并影响治疗效果。2013年的一项研究设计了靶标HIV-1基因组不同区域(长末端重复LTR和pol)的两种探针。研究人员用这两个探针分别进行RPA扩增,然后进行荧光检测和侧流层析试纸检测。研究表明,这样的方法能够可靠地检测到3拷贝的前病毒DNA。研究人员在此基础上测试了多个HIV-1突变株,pol和LTR引物的扩增率分别为98.6%和93%。

这是一个能检测出HIV-1所有主要亚型的等温扩增法,能够在资源匮乏的地区帮助人们诊断携带被HIV感染的婴儿。(文献:Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification, MBio.)

HIV DNA的实时定量检测

今年五月,研究人员使用内参和标准曲线,通过RPA扩增定量了HIV-1 DNA的浓度。这是一种基于实时荧光数据的定量RPA技术,被称为qRPA。

这项研究通过一系列试验,分析和定量了不同浓度的HIV-1 DNA样本。研究显示,在所有测试的浓度范围内,qRPA的预测值与正确值在一个数量级以内。可见,定量RPA(TwistAmp exo)可以作为核酸定量的有力工具,用于即时检测和体外诊断。(文献:Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification, Analytical Chemistry)

不插电的HIV DNA检测

绝大多数核酸扩增(包括等温扩增)都需要电。但在资源匮乏的区域,最好是有不需要持续供电的诊断工具。RPA的工作温度在25-43°C之间,不需要严格控制孵育温度,就能达到理想的性能。

今年九月的一项研究显示,当室温在31°C - 43°C之间时,孵育20分钟RPA反应就能成功进行,检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

当室温降到30°C以下时,RPA的扩增性能有所下降。为此,研究人员开发了一个简单的化学加热器,在室温10-30°C时孵育HIV-1 RPA反应。研究显示,RPA的性能通过加热孵育得到了恢复,能检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

研究人员在15°C、20°C、25°C和30°C,用这种加热器进行了12个RPA反应,结果全部扩增成功。他们还发现,当温度较低时,孵育30分钟能促进RPA的扩增性能。研究表明,对RPA HIV-1反应进行化学加热,与电力设备效果差不多。这也说明,RPA HIV-1检测不需要多好的设备,就可以实现高灵敏度的诊断。(参考文献:Non-Instrumented Incubation of a RPA Assay for the Rapid & Sensitive Detection of Proviral HIV-1 DNA. PLoS One)

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