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糖尿病

谷涌泉教授:脐带血干细胞移植治疗糖尿病下肢慢性缺血的临床研究

来源:    时间:2018年04月11日    点击数:    5星

一、概论

随着生活水平的提高和老龄人群的增多,肢体缺血性疾病患者在逐渐增加,尤其是伴随着近年来糖尿病发病率的迅速增加,糖尿病下肢慢性缺血患者人群明显较前增多。糖尿病的存在,会造成缺血程度进展更快、缺血动脉病变的硬化钙化更加严重、病变范围更大。虽然新的药物不断出现,手术方法不断改进尤其介入治疗技术和器材迅速发展,但仍然有许多糖尿病下肢慢性缺血患者最终不得不面临截肢风险。

已经出现下肢缺血表现的糖尿病患者往往身体情况很弱,无法耐受手术;很多患者的肢体远端动脉流出道血管条件差,使得介入治疗难度大、风险高、对于没有流出道血管的患者,往往治疗效果不好。对于此类患者(No Option Patients),外科医生以往都是束手无策,只能采取药物保守治疗维持,因此截肢率非常高。

(一)脐带血干细胞移植治疗的背景和优势

1.治疗背景脐血干细胞移植(cord blood stem cell transplantation,CBSCT)是一种造血干细胞移植技术。1988年,法国人Gluckman应用脐血成功治疗了1例罹患Fanconi贫血的5岁幼童,从此拉开了脐血干细胞移植在各个疾病治疗领域发挥作用的序幕。目前脐血移植治疗的疾病已经达到80余种,治疗的患者全世界已经超过了6000例。脐血移植已经在恶性肿瘤、免疫缺陷、心脏病、神经系统损伤、组织器官修复、糖尿病等治疗上显示出了巨大的潜力。从目前其他学科的临床治疗应用中初步可以看到,脐血具有诸多优势,如来源丰富,抗原表达弱,加之间充质干细胞的免疫调节及加速造血恢复等影响,脐血的移植成功率高,移植反应弱、移植物抗宿主病少见。

2.治疗优势近年来,随着再生医学的发展,干细胞移植为这类患者带来了治疗希望。传统的干细胞治疗手段包括骨髓血干细胞、外周血干细胞,虽然二者目前已经证实可以作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的有效手段,但自身还是存在一定的局限。移植之前骨髓动员存在一定风险,尤其是考虑目标人群高龄和易合并多种心脑血管疾病、高血压、高血脂的特点,骨髓动员时引起的外周血白细胞升高、血液粘稠度增加及血液流变学改变,会增加心肌梗死和脑梗死的发病率,骨髓动员过程中发生意外的可能性要明显高于正常人群,采用脐血干细胞移植就能够避免这些风险。

脐血干细胞移植较骨髓或外周血干细胞移植有其独特的优势:①脐血干细胞来源广泛,取材方便,不会造成痛苦;②富含多种分化潜能的细胞、造血前体细胞及细胞因子,对缺血局部作用更强;③脐血干细胞抗原性低,发生免疫排斥反应机会少;④脐血有胎盘的过滤保护,发生感染的机会更少;⑤骨髓干细胞自体移植,往往需要采集患者骨髓血的量比较大,一般需200ml,该失血量对于高龄患者而言本身就存在生命危险;⑥合并下肢血管病变等慢性并发症患者多为年龄较大的中老年患者,由于其自体干细胞数量及分化能力的下降,常伴有外周血内皮祖细胞数量减少,且增殖、迁移潜力、黏附和成血管能力均减弱;与使用其外周血干细胞或骨髓干细胞移植治疗相比,脐血富含内皮祖细胞、造血干细胞及间充质干细胞;⑦骨髓干细胞中内皮祖细胞的功能较正常明显下降,将影响移植的效果。因此,如果脐血干细胞移植和骨髓及外周血干细胞移植同样有效,那么脐血干细胞移植来源更广泛,移植方法更简单,将成为治疗糖尿病下肢慢性缺血的新选择。

(二)脐带血干细胞治疗的相关机制研究

血管新生有血管生成和血管形成两种方式:血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖,在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管;血管形成是指在原来没有血管系统的情况下,通过内皮祖细胞和造血干细胞的分化和相互作用产生新的血管。干细胞移植后一方面整合于受损的血管丛,进而直接分化、成熟为新血管;另一方面以直接分泌和旁分泌细胞因子方式促进局部缺血组织的血管新生。

脐血干细胞具有特殊的生物学特性,其中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞(Cluster-Designation,CD),CD34抗原是造血干细胞分离纯化的主要标记,脐血中CD34+细胞占有核细胞的比例与骨髓相似,高于外周血。其中早期造血前体细胞CD34+CD38-和CD34+Thy-1+lin-亚群比例高于骨髓和外周血,具有更强的增殖和分化能力。脐血中高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)传代达5代,在第5代仍可见混合形成集落单位,与骨髓相比脐血中的HPP-CFC更为原始。脐血干细胞具有很强的增殖、分化及形成集落的能力,受到刺激进入细胞周期的速度及对各种造血刺激因子的反应能力均高于骨髓和外周血细胞,并且寿命更长。脐血免疫细胞发育相对不成熟,由于免疫原性较弱,干细胞具有不易被排斥、能在体内长期存活的特征,也被称为“免疫逃逸”现象。

目前基础研究初步表明,干细胞治疗主要依靠的是旁分泌机制。脐血干细胞同样具有旁分泌的作用,表现为分泌多种血管生成因子、细胞因子和免疫调节物质,能够协同作用于病变部位利于血流恢复、减弱炎症反应及促进糖尿病足溃疡愈合,这些也都成为了糖尿病慢性下肢缺血疾病细胞疗法的研究热点。

基于干细胞可分化为内皮祖细胞分泌多种细胞因子利于血管新生的理论基础,彭艳等将脐血干细胞经尾静脉注射于糖尿病大鼠缺血、溃疡模型中,结果表明注射内皮祖细胞组大鼠腓肠肌毛细血管密度及血管内皮生长因子mRNA量较对照组显著增加,并且根据荧光标记证实来源于脐血的内皮前体细胞参与新生血管形成。杨华强等采用人脐血间充质干细胞多点注射于2例糖尿病足患者肌肉中,随访3个月结果显示2例患者疼痛、冷感及间歇性跛行等下肢缺血症状均明显改善,CT下肢血管造影结果显示侧支循环较移植前丰富,期间无任何不良反应产生。Shrestha等将从脐带分离的间充质干细胞移植到糖尿病小鼠溃疡周围组织中,结果证明促进糖尿病小鼠伤口愈合是通过促进表皮细胞再生、血管生成和旁分泌多种因子等途径完成。

(三)脐带血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血的动物研究

Finney等研究人脐血单个核细胞通过肌注移植治疗NOD/SCID鼠下肢缺血模型,其毛细血管密度明显升高。杨耀国发现移植培养扩增的脐血干细胞可以改善糖尿病裸鼠缺血局部的皮温、增加缺血局部的血管密度、促进缺血恢复;缺血组织中转化生长因子β1和CD105的表达增高可能对缺血恢复有重要作用。杨晨等将从人脐血CD133+细胞诱导出的,经尾静脉移植到后肢单侧缺血的裸鼠体内,缺血后肢的毛细血管密度、血流灌注及坏死程度均较对照组明显改善。血管生长因子是以同源二聚体形式存在的糖蛋白,对血管的生成以及新生血管的发生均具有重要的调节作用。谢丽华等使用脐带血干细胞治疗糖尿病大鼠的下肢缺血模型,发现移植后1、2、4周血管内皮生长因子水平、毛细血管密度、经皮氧分压水平整体均呈现出不断上升的情况,与移植前比较差异均有显著性意义(P<0.05)。分析出现该现象的原因,可能是因为脐血干细胞可以表达、合成并分泌诸多具有较强生物活性的因子,对缺血部位新生血管的形成产生十分积极的促进作用。

干细胞移植治疗过程中的安全性也是一个重要的评价方面,包括免疫排斥以及肿瘤生长。理论上,干细胞移植后,可能会在移植部位发生分化,存在出现肿瘤样生长现象的风险,从目前的诸多相关动物研究结果看,均未出现严重皮肤出血、皮炎以及局部红、肿、热、痛等炎症反应,肝脏、心脏等脏器均未出现瘤样生长。

二、脐带血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血的临床研究

(一)临床研究的进展

韩国的Kim团队在2006年将脐带血间充质细胞通过肌注移植治疗血栓闭塞性脉管炎取得成功,是目前公认的世界最早将脐带血干细胞应用于下肢缺血性疾病的临床尝试。一共治疗了4例患者,结果显示:4例患者缺血程度均明显改善。细胞移植后患者静息痛缓解、肢体皮肤溃疡4周内愈合,血管阻力降低,血管造影显示肢体远端毛细血管密度增加、直径增大。

Yang等观察了8例脐带血干细胞治疗的下肢重度缺血患者(均为男性,平均年龄52岁,范围31~77岁)。患肢注射脐带血干细胞1×107/针,主要安全终点包括手术相关并发症、注射过敏、移植宿主病和心脑血管事件。临床评价包括足部溃疡愈合情况、踝肱比值、无疼痛步行距离。血管新生通过常规动脉造影进行评估。8例患者中出现4例不良事件,1例患者注射次日出现皮肤荨麻疹,给予抗组胺药物治疗后次日消失。其他不良事件分别为腹泻、口腔溃疡和血肌酐指标升高,均未经治疗自行消失。4例溃疡患者中3例(75%)完全愈合。8例患者中3例患者的血管造影评分升高。

毛红等观察89例2型糖尿病下肢血管病变患者脐血干细胞移植治疗临床效果,所用患者均皮下注射重组人粒细胞集落因子500~600μg/d,注射5天后采集脐血干细胞,将采集的脐血干细胞悬液进行缺血肢体肌间分层注射,移植后1,3和6个月患肢疼痛、冷感、间歇性跛行情况较移植前均有改善,且随着时间延长改善程度逐渐增加,踝肱指数均有不同程度增高;移植后患者肢体皮温较移植前有所升高,深部感觉检测肢体感觉功能有所改善;移植后患者下肢血管彩色多普勒与移植前比较未见明显变化,CT及血管造影显示23例患者有不同程度新生侧支血管形成,说明脐血干细胞移植可增加糖尿病下肢血管病变与糖尿病足患者的下肢血流,促进部分患者下肢血管新生。

陈明卫等对不同来源和移植途径的脐血干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变进行了随机对照观察,选择糖尿病缺血性下肢血管疾病患者76例,分为4组,分别为脐血干细胞局部肌内注射移植和动脉腔内注射移植,自体骨髓干细胞局部肌内注射移植和动脉腔内注射移植,移植后第2、4、12、24、48周4组患者疼痛评分、冷感评分、麻木评分、皮肤温度、踝肱指数、持续经皮氧分压、间歇性跛行距离、下肢动脉的CT血管成像评分差异无显著性意义,表明采用不同来源和移植途径的脐带血细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变疗效相当。高雪等观察了干细胞重建糖尿病足缺血态组织血流,对糖尿病下肢动脉缺血性疾病患者42例进行脐血干细胞移植,随访1年,干细胞移植后患者肢体局部血流量变效应指标皮温指数、经皮氧分压、踝肱指数、光电容积微血流态指数、血氧饱和度、数字减影血管造影评分及间歇性跛行距离均得到改善。

虽然文献检索可见一些相关临床研究的病例报告,但绝大多数是回顾性文章,且普遍存在样本量小,随访时间短等不足,缺乏具有循证医学效力的高质量临床研究结果。Gupta等于2013年发表的间充质干细胞治疗下肢重度缺血的RCT研究报告是目前唯一的相关高证据等级文献。该研究随机入组20例患者。发现踝肱比值和踝部压力增加值,间充质干细胞组明显更高。严重不良事件发生率,两组无显著差异。肌注间充质干细胞在200万个细胞数/千克体重情况下是安全的。6个月随访踝肱比值和踝部压力增加值,间充质干细胞组明显更高。溃疡面积愈合率和截肢率,两组无显著差异,分析其原因和研究入组患者下肢缺血程度过重相关。

首都医科大学宣武医院至2016年3月完成3例脐带血干细胞治疗严重下肢慢性缺血病例。具体情况如下:

病例1 90岁女性,无高血压、冠心病等合并症。外院股浅动脉支架术后闭塞,干细胞容量40ml,干细胞浓度8.7×108,活性99%。术前患肢ABI 0.40,术后3个月0.42,术后6个月0.46。术前胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为47/41(与胸前比为0.87)/39(与胸前比为0.83)mmHg。术后3个月胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为39/45(与胸前比为1.15)/47(与胸前比为1.21)mmHg。

病例2 87岁女性,酗酒,合并糖尿病、高血压。干细胞容量40ml,干细胞浓度1.0×109,活性99%。术前患肢ABI0.29,术后3个月0.23,术后6个月0.29。术前胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为50/4(与胸前比为0.08)/3(与胸前比为0.06)mmHg。术后3个月胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为57/7(与胸前比为0.12)/50(与胸前比为0.87)mmHg。例3,73岁男性,合并糖尿病、高血压。1个月前外院试行左膝下动脉球囊扩张未成功。干细胞容量40ml,干细胞浓度1.2×109,活性99%。术前患肢ABI0.39,术后3个月0.45。术前胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为47/43(与胸前比为0.91)/29(与胸前比为0.62)mmHg。术后3个月胸前/患足/小腿经皮氧分压分别为26/(与胸前比为0.76)/19(与胸前比为0.55)mmHg。三例患者的静息痛程度均明显减轻,疼痛评分下降,复查动脉造影可见新生侧支血管(图1,图2)。

图1 脐带血干细胞治疗前后造影结果对比 A.术前造影;B.脐带血干细胞治疗术后3个月造影复查所见,红色箭头所指区域可见明显血管新生和再通

图2 脐带血干细胞治疗前后造影结果对比 A.术前造影;B.脐带血干细胞治疗术后3个月造影复查所见,为同一角度位置的不同显影时相;红色箭头所指区域可见明显血管新生和再通

(二)临床实施一般步骤

1.脐血干细胞来源及分离、鉴定脐血干细胞免疫原性小、淋巴系统细胞含量少且不成熟,社会伦理限制较小,目前研究上多采用异体脐血干细胞,一般来源于足月产胎儿,产妇一般情况良好,排除合并糖尿病、高血压、冠心病等慢性病及肝炎、梅毒等传染性疾病,经产妇理解同意并签署知情同意书后于分娩过程中获取。随着中国逐步完成脐血库的建立,未来在治疗缺血性疾病时应用自体脐血分离得到的内皮前体细胞就不存在免疫排斥反应相关问题。

脐血干细胞的制备方法主要包括直接分离法和细胞培养法,其中直接分离法包括流式细胞分析技术及Ficoll密度梯度离心法:①直接分离法:利用流式细胞检测仪根据脐血干细胞表面CD34、CD133抗原分离出未分化干细胞,其中CD31和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)为内皮祖细胞典型标志,故多筛选CD133、CD31抗原阳性及VEGFR2阳性的细胞为内皮祖细胞群。此种分离方法分离出的内皮祖细胞纯度较高,但数目非常小,且细胞活性影响较大,花费较高,操作程序复杂且容易污染。

Ficoll密度梯度离心法是根据血细胞及血浆等成分的密度不同,利用淋巴细胞分离液于无菌操作台中经高速低温离心技术进行分离、洗涤,将得到的脐血单个核细胞利用光学显微镜及细胞计数板获取符合要求浓度的单个核细胞悬液,分装置于-80℃冻存备用。该方法特点是细胞纯度不高,较经济、操作简便易行。②细胞培养法:上述直接分离法中经Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞,其主要细胞成分包括造血干细胞、内皮祖细胞及间充质干细胞,进一步经过贴壁筛选获得纯度相对较高的内皮前体细胞,经纯化的内皮祖细胞可于体外进行诱导分化为成熟的内皮细胞。未经纯化的内皮前体细胞在增殖及迁移能力方面显著高于诱导分化后的细胞,且可经大量扩增后制备细胞悬液待用。由该方案得到的内皮祖细胞浓度较高,细胞活性可靠,操作方法简单且相对经济,在临床及实验研究中获得广泛采用。

2.脐血干细胞治疗下肢缺血性疾病的移植途径包括局部肌内注射法及血管腔内注射法。①局部肌内注射法:将制备好的干细胞悬液0.5mL,沿患肢股动脉及其分支走向,注入缺血肢体肌肉内,间距1.0cm;②血管腔内注射法:介入下将导管预置于病变节段近端,将制备好的干细胞悬液经导管注射入远端动脉腔内,目前该疗法临床应用较少。

3.脐带血干细胞治疗的临床评估

参考文献

[1]Gluckman E,Broxmeyer HA,Auerbach AD,et al.Hematopoietic recon-stitution in apatient with Fanconi′s anemia by means of umbilica cord blood from an HLA-identical sibling.NEnglJMed,1989(17):1174-1178.

[2]Hao QL,Shah AJ,Thiemann FT.A Functional comparison of CD34 + CD38-cells in cord blood and bone mallow.Blood,1995,86(10):3745-3753.

[3]Ruggeri L,Aversa F,Martelli MF,et al.Allogeneic hematopoietic transplantation and natural killer cell recognition of missing self.Immunol Rev,2006,214(1):202-218.

[4]Finney MR,Fanning LR,Joseph ME,et al.Umbilical cord blood-selected CD133(+) cells exhibit vasculogenic functionality invitro and in vivo.Cytotherapy,2010,12(1):67-78.

[5]杨晨,张志华,卢士红,等.脐血内皮祖细胞移植改善肢体缺血的研究.中华医学杂志,2003,83(16):1437-1441.

[6]Kim SW,Han H,Chae GT,et al.Successful stem cell therapy using umbilical cord blood-derived multi-potent stem cells for Buerger’s disease and ischemic limb disease animal model.Stem Cells,2006,24(6):1620-1626.

[7]彭艳,徐玲,徐勇.脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究.中国糖尿病杂志,2013,21(1):76-79.

[8]杨华强,李东升,杜玲,等.脐血干细胞移植在糖尿病足治疗中的应用:附二例报告.中国全科医学,2010,13(23):2551-2553.

[9]毛红,赵湜,王红祥,等.自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变与糖尿病足效果:89例自身对照观察.中国组织工程研究与临床康复,2008,12(21):4197-4200.

[10]陈明卫,李燕萍,唐益忠,等.不同来源和移植途径的自体干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变的随机对照研究.中华临床医师杂志:电子版,2013,7(14):6418-6423.

[11]高雪,叶吉云,曾希云,等.干细胞重建糖尿病足缺血态组织血流.昆明医科大学学报,2012,33(10):57-60.

[12]Yang SS1,Kim NR,Park KB,et al.A phase I study of human cord blood-derived mesenchymal stem cell therapy in patients with peripheral arterial occlusive disease.Int J Stem Cells.2013;6(1):37-44.

[13]Gupta PK,Chullikana A,Parakh R,et al.A double blind randomized placebo controlled phase I/II study assessing the safety and efficacy of allogeneic bone marrow derived mesenchymal stem cell in critical limb ischemia.JTransl Med,2013,10;11:143.

[14]张弛,肖日军,张娜,等.脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究.中华损伤与修复杂志(电子版),2012,01:18-23.

[15]李翠芳,姚远.脐血干细胞移植2型糖尿病下肢血管病变患者内皮依赖性血管舒张的变化.中国组织工程研究,2014,50:8098-8102.

[16]马红芳,王富军.脐血干细胞移植及血管成形治疗糖尿病下肢缺血性疾病.中国组织工程研究,2015,23:3755-3760.

[17]谢丽华,邢琳,郑航.脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血的可行性.中国组织工程研究,2016,01:78-82.

[18]袁平,潘扬,骆晓鸿.脐血干细胞治疗下肢动脉慢性缺血性疾病.贵阳医学院学报,2011,01:60-61+64.

[19]周慧敏,刘璠,杨爱格,等.脐带血单个核细胞移植治疗对2型糖尿病下肢血管病变患者血清VEGF和bFGF的影响.广东医学,2015,19:3021-3023.

谷涌泉,医学博士,主任医师,教授,现任首都医科大学宣武医院血管外科主任。兼任国际脉管联盟副主席及候任主席,中华医学会组织修复与再生医学分会副主任委员,中华医学会医学工程学分会常委及干细胞工程专业学组组长,中华医学会外科分会血管外科学组委员,北京市血管外科学分会副主任委员,中国生物医学工程学会组织工程与再生医学分会副主任委员,中国医师协会外科医师分会血管外科医师委员会副主任委员,中国医促会糖尿病足分会主任委员;International Angiology杂志专家编委,《中华细胞与干细胞电子杂志》《介入放射学杂志》副主编等。

 

 

来源:人民卫生出版社《临床知识》约稿
作者:谷涌泉,首都医科大学宣武医院血管外科主任;郭建明
编辑:环球医学资讯贾朝娟
 

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