一、脑脊液标本

1.标本采集

经腰椎穿刺术或脑室内引流管，无菌留取脑脊液数毫升送检。脑脊液常见病原菌如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等离体后极易死亡，因此，标本采集后应及早送检，不应冷藏于冰箱中。

2.涂片检查

（1）一般细菌涂片：

混浊脑脊液可直接涂片，革兰氏染色并镜检。无色透明的脑脊液，以3000r/min离心10～15分钟，取沉淀物涂片并做革兰氏染色及镜检。根据染色及形态特征，可初步判断细菌的种类：革兰氏阴性、凹面相对的球菌，可能是脑膜炎奈瑟菌；链状排列的革兰氏阳性球菌，可能是链球菌；长丝状等多形态的革兰氏阴性杆菌，可能是流感嗜血杆菌。

（2）结核分枝杆菌涂片：

取脑脊液标本离心（3000r/min，15分钟）后的沉淀物作抗酸染色。一张玻片上通常只能找到1～2个结核分枝杆菌（图1），因此镜检时需仔细查看。

（3）新型隐球菌涂片：

取脑脊液标本离心（3000r/min，15分钟）后的沉淀物做墨汁染色，如图2所示，可在黑色背景中见到折光性很强的菌体，周围有宽大透明的荚膜，有时还可见到单芽。新型隐球菌，特别是荚膜狭窄者易与白细胞混淆，可用0.1%甲苯胶兰染色加以区别：新型隐球菌的菌体呈红色圆球状，荚膜不着色，白细胞染色呈深蓝色，红细胞不着色。

图1 抗酸染色可见结核分枝杆菌
箭头所指处为结核分枝杆菌。

图2 脑脊液墨汁染色可见新型隐球菌
亮色圆形为新型隐球菌。

3.培养

用接种环挑取混浊脑脊液或离心（3000r/min，15分钟）后的沉淀物，分别接种于增菌肉汤和血琼脂平板和/或巧克力平板和/或沙氏平板和/或厌氧血平板上，置于35℃二氧化碳环境或者厌氧环境中培养。对于接种至血培养瓶中的脑脊液标本，在仪器报警后，根据涂片、染色、镜检结果转种至相应培养基，根据镜检所见及菌落特征，初步判定细菌种类。

二、穿刺液或引流液标本

1.标本采集

无菌穿刺留取可疑感染部位的液体（胸腔积液、腹水、心包积液、胆汁、关节液、鞘膜液等），置入无菌容器后立即送检。怀疑厌氧菌感染者需在床边接种。

图3 穿刺液或引流液标本革兰氏染色结果
A.可见满视野革兰氏阳性球菌（箭头所示）；B.可见满视野革兰氏阴性杆菌（箭头所示）；C.可见满视野真菌孢子（箭头所示）；D.可见数个曲霉菌（箭头所示）。

2.涂片检查

脓性标本可直接涂片，清亮标本取离心（3000r/min，15分钟）后的沉淀物涂片，自然干燥或烘片机烘干，再进行革兰氏染色，如图3，可找见革兰氏阳性球菌、阴性杆菌、真菌孢子、曲霉菌等，或进行抗酸染色。

3.培养

（1）普通细菌培养：

接种血琼脂平板，巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板（或EMB及中国蓝琼脂平板），5%～10%二氧化碳条件下，35℃培养18～24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断。

（2）厌氧菌培养：

床边接种或从厌氧运送培养基转种后，立即置于厌氧环境中，35℃培养24～48小时；挑取可疑菌落做耐氧实验，确定是否为厌氧菌。

（3）结核菌培养：

离心后取沉淀物接种于罗氏培养基，35℃下培养3～4周，观察有无可疑菌落出现。

三、尿液标本

1.标本采集

留取中段尿作为送检标本，若需厌氧菌培养，则需行耻骨上膀胱穿刺留取标本。

2.涂片检查

清亮尿液标本取5～10ml，3000r/min离心10分钟后，取沉淀物1ml，用细胞离心机（2000r/min离心5分钟）制备涂片，革兰氏染色并镜检。若为混浊的尿液，可将未离心的尿液标本混匀后取10μl涂片，待干，固定后进行革兰氏染色，油镜下观察有无细菌、白细胞和上皮细胞，一般认为每油镜视野下检出1个细菌相当于104～105CFU/ml尿液标本。女性尿液标本中如果存在较多扁平上皮细胞，无论有无细菌，均提示标本很可能受到阴道细菌的污染，应重新送检。

3.培养

分为定性培养及定量培养。定性培养时，用定量接种环取离心后的尿液1μl或10μl分别接种于血琼脂平板和麦康凯琼脂平板，置于二氧化碳环境中35℃培养18～24小时，观察有无细菌生长，根据菌落特征及涂片、染色结果选择相应的鉴定方法；若培养2天未见细菌生长则弃去标本不再继续培养。定量培养时，用无菌定量接种环（一般10μl或1μl）取尿液1环接种于血琼脂平板上并涂匀，35℃培养18～24小时，计数生长的菌落数，乘以100或1000，求出每毫升的菌落数。淋病奈瑟菌培养选用巧克力琼脂平板，并放入二氧化碳环境中培养。厌氧菌培养必须进行膀胱穿刺的尿液标本，并接种到厌氧琼脂平板。尿路感染细菌培养的诊断标准如下：急性单纯性膀胱炎中段尿培养菌落数≥103CFU/ml；急性单纯性肾盂肾炎中段尿培养菌落数≥104CFU/ml；女性中段尿培养菌落数≥105CFU/ml，男性中段尿培养菌落数≥104CFU/ml。对于复杂性尿路感染，应多次送检中段尿标本，清洁中段尿培养菌落数女性>105CFU/ml、男性>104CFU/ml或患者导尿留取的所有尿液标本菌落数均>104CFU/ml具有诊断价值。中段尿液标本不可置肉汤中进行增菌培养。若尿液培养同时≥3种细菌生长时，可视为污染标本，需重新送检。

四、脓肿及创面分泌物标本

1.标本采集

开放性脓肿时，以无菌盐水冲洗溃疡表面，用无菌棉签获取溃疡深部分泌物后插入斯氏运送培养基内送检。封闭性脓肿时，消毒局部皮肤或黏膜表面后用注射器抽取脓液，再注入无菌试管内送检。疑为厌氧菌感染时，应做床边接种或置厌氧运送培养基内送检。

2.涂片检查

脓液及创面分泌物标本均应做涂片检查。涂片做革兰氏染色镜检，根据形态和染色特点，鉴定出相应菌种：若见交织的菌丝，其末端稍微膨大似棒状、放射状排列，有时可见嵌于类似明胶的鞘膜内，革兰氏染色阳性，抗酸染色阴性，可能为放线菌感染；若见革兰氏阳性的分枝菌丝，且抗酸染色弱阳性，则可能为诺卡菌感染（图4）；在镜下观察找到革兰氏阳性杆菌，应注意是否有芽孢及其在菌体的位置：若革兰氏阳性细长杆菌的芽孢呈正圆形，在菌体顶部且大于菌体宽度，呈“鼓槌状”，可能为破伤风梭菌感染；若革兰氏阳性细长杆菌无芽孢，应加做抗酸染色。

图4 脓性标本找见诺卡菌
箭头所指处为诺卡菌。

3.培养

普通细菌培养时，取脓液标本接种于血琼脂平板和麦康凯琼脂平板，在二氧化碳条件下35℃培养18～24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断，再按各类细菌的生物学特性进行鉴定；厌氧菌培养时，取脓液标本接种于厌氧血琼脂平板或其他厌氧选择平板，置于厌氧环境培养，根据生长特性及涂片、染色结果，按厌氧菌生物学特征进行鉴定；结核分枝杆菌培养时，取脓液标本约0.1ml直接接种到结核分枝杆菌培养基，组织或脏器应先进行粉碎然后进行培养；真菌培养一般选择沙氏培养基。

（郑瑞强）

参考文献

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知识来源
人卫知识数字服务体系
作者：郑瑞强教授，苏北人民医院

专家简介
郑瑞强，主任医师，副教授，博士研究生导师，苏北人民医院副院长。
江苏省第三批、第四批和第五批333人才工程第三层次培养对象，荣获江苏省有突出贡献中青年专家称号。荣获全国先进工作者、全国五一劳动奖章、全国防疫先进个人、江苏省优秀共产党员和江苏省医德医风标兵称号。兼任中国医师协会重症医学分会委员、中国卫生信息与健康医疗大数据学会重症分会常务委员、中国医师协会体外生命支持医师分会委员、江苏省医学会重症医学分会副主任委员、江苏省医师协会重症医学分会常委兼总干事、扬州市医师协会常务理事、扬州市医学会重症医学专业委员会主任委员。曾任中华医学会重症医学分会青年委员。担任《中华危重病急救医学杂志》通讯编委、《中华重症医学杂志电子版》编委。目前主持江苏省社会发展重大项目1项、中华医学会科研基金1项，主要参与国家级、省级多项科研课题。
专业特长：致力于重症医学临床、教学和科研20余年，在多器官功能不全的发病机制和治疗的基础研究与临床救治方面具有较高造诣，尤其在感染性休克的发病机制和集束治疗在ARDS发病机制和保护性通气治疗方面在国内处于领先水平。