重症患者发生病毒感染常出现在呼吸道和神经系统，会显著增加患者的死亡率和病死率。因此，利用各种检测技术实现早期明确病毒诊断尤为重要。引起成人病毒性肺炎的常见原因是流感病毒、呼吸道合胞病毒，其中免疫抑制患者还常常出现：巨细胞病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒和麻疹病毒。而引起神经系统感染常见的病毒为疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒。本文主要介绍常见病毒的诊断技术。

一、采集与送检标本

病毒性疾病通常可采集血液、鼻咽分泌物、痰、粪便、脑脊液、疱疹内容物、活检组织等以供实验室工作人员分离病毒、检出核酸或抗原。

采集标本和送检时最好做到以下几点：

1.取材要尽早
尽可能在发病初期（急性期）取材以提高病毒检出的阳性率。

2.部位要准确
在感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽部分泌物、痰液或者支气管肺泡灌洗液；神经系统感染采取脑脊液；肠道感染留取粪便等。

3.要冷藏速送
为避免病毒离体后在室温下死亡，应尽快将检材放入装有冰块或干冰的空器内送检。

二、分离病毒

一般分离病毒的程序是：无菌标本（血液、血浆、血清、脑脊液）可直接接种细胞、易感动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗涤后制成10%～20%悬液离心后，取上清接种；咽拭子、粪便、尿及其他感染组织等污染标本在接种前先用抗菌药物（青霉素或者链霉素）处理。

1.细胞培养

用分散的活细胞培养称细胞培养。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH 7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

原代细胞培养，用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，可用于产生病毒疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

二倍体细胞培养，原代细胞只能传2～3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

传代细胞培养，通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如 Hela、HEp-2、Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。

淋巴细胞培养，正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在T细胞生长因子下可在体外培养，为研究人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）提供了条件，HIV 在 T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。

2.动物试验

这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉，例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种1周龄乳鼠的腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。

3.鸡胚培养

用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养，但很多病毒在鸡胚中无法生长。

总之，病毒培养相对困难，综合而言不利于临床诊断工作。为了加快病毒分离的过程，病毒快速培养方法如离心增强技术（也叫shell vial法）的出现使试验周期大大缩短，从1周缩短至1～2天。shell vial法的检测原理为应用单克隆抗体特异性结合巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）抗原，通过免疫染色技术使标本中的被感染细胞直接显影。主要步骤如下：将病毒接种在含有盖玻片的细胞培养瓶中，经低温离心后，可以增加病毒与细胞接触的概率，再将盖玻片进行培养，隔天使用单克隆抗体染色，由检测病毒的早期抗原进行诊断。此方法的优点是：缩短检测时间，一些生长速度较慢的病毒，如巨细胞病毒、流感病毒、登革病毒和呼吸道病毒等，若用传统病毒培养，需要1周至1个月，利用shell vial法可以将时间缩短至2天。近年来，shell vial法显著提高了各种病毒包括流感病毒、登革病毒和呼吸道病毒等的分离效率。

三、鉴定病毒

（一）病毒在细胞内增殖的指征

1.细胞致病作用

一些病毒感染细胞后虽不至于造成细胞死亡，但会在一定时间（5～20天）后让细胞发生变性，称为细胞致病作用（cytopathogenic effect，CPE）。不过，并不是所有类型的病毒在组织培养时都会造成CPE。因此，为了观察到CPE，需注意要选择相匹配的病毒和细胞类型来进行该检测。

病毒在细胞内增殖引起细胞退行性变，表现为细胞皱缩、细胞肿大变圆（可堆积成“葡萄状”）、出现空泡、死亡和脱落，还可以伴发出现多核巨细胞（合胞体）、红细胞吸附现象，干扰并阻止其他病毒的细胞致病作用。某些病毒产生特征性CPE，普通光学显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。

免疫荧光（immunofluorescence，IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。

2.红细胞吸附现象

流感病毒和某些副黏病毒感染细胞后24～48小时，细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

3.干扰现象

一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再产生CPE。

（二）病毒感染性的定量测定

1.病毒空斑试验

病毒空斑试验是一种通过测定空斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）来检测病毒滴度的方法，这种方法被广泛应用于定量各种病毒。一个蚀斑通常是由最初感染培养的宿主细胞单层的一个病毒颗粒形成。在做空斑实验时，需要将病毒液做10倍梯度连续稀释，再分别感染相应的敏感细胞单层，接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，孵育一段时间后，在细胞单层上覆盖一层半固体培养基（最常用的是琼脂糖）以防病毒从一开始的宿主细胞扩散至附近未感染的细胞。这样，每个病毒颗粒会在单层细胞上形成一个由未感染细胞围绕的小圆斑即称为空斑，当空斑长到足够大时，可在显微镜下观察到甚至直接肉眼可见。计数病毒在不同稀释浓度下的空斑形成数量，即可得到每毫升病毒颗粒数或每毫升空斑形成单位。由于每个空斑来自于起初的1个病毒颗粒，这样可以从单个空斑中纯化得到来源于单个克隆的病毒种群。

实际工作中，为了更清楚地辨别空斑，需要对细胞用 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）或中性红等染料进行染色以增加细胞与空斑间的对比度。另外，细胞状态对于空斑试验成功与否至关重要，需要使用处于对数生长期且活力大于95%的健康的宿主细胞。病毒空斑试验比较费时，根据病毒种类不同，通常需要4～10天时间。空斑试验只适用于那些能够繁殖并能感染培养细胞单层的病毒，以及可以破坏细胞的病毒。

2.50%组织细胞感染量

空斑试验对于确定病毒滴度非常有用，然而有些病毒在培养时不会形成空斑。这种情况下，它们的滴度可以用50%组织细胞感染量 （50% tissue culture infective dose，TCID50）方法检测。TCID50是指使一半的单层细胞培养发生细胞病变或死亡的病毒量。具体操作方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液做10倍连续稀释，接种于鸡胚、易感动物或组织培养中，经过一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，经统计学方法分析计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得较准确的病毒感染滴度。

获得的数据可以用统计学方法进行分析。在缺少实验材料或成本不够的情况下，TCID50检测法是很好的选择。虽然该检测法得到的病毒滴度的精确性和重复性不是很高，但可以很好地得到一个大致的滴度及用于评价各处理组间的差异。空斑实验的相对误差有10%～100%，而TCID50检测法为35%左右。不过，TCID50通常比较耗时，因为它需要在培养的细胞中进行病毒感染，整个过程可能需要7天时间。

3.流式细胞术

通过流式细胞仪分析各类形态和基因组大小各异的病毒来进行病毒定量，可用于实验室生物样本的病毒计数及多种病毒感染的实际诊断。流式细胞术（flow cytometry，FCM）比空斑试验更高效。跟荧光显微镜法相比，FCM法可在单细胞水平获得统计学上可靠的数据，且花费的精力相对较少。FCM得到的荧光分布结果还可进一步用于病毒蛋白合成及病毒颗粒释放等数据的统计估算和数学建模。一般来讲，FCM病毒颗粒检测法敏感度不高，但某些商品化的FCM方法可以简单快速地进行病毒定量且敏感度较高。在病毒计数时，每个样本先用2种不同的荧光染料染色：一个特异的染核酸，另一个染蛋白，孵育30分钟后，将染色样本置于病毒计数仪器上分析以计算病毒颗粒的浓度（vp/ml）。

（三）观察病毒形态与结构

大部分病毒颗粒都非常小，无法在光镜下直接观察，病毒悬液经高度浓缩和纯化后，可通过透射电镜观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步区分病毒。虽然透射电镜法目前正逐渐被敏感度更高的PCR和免疫荧光等方法所取代，但在病毒学研究的某些方面，如发现新病毒、病毒特征描述及滴度测定等，透射电镜仍然十分必要。使用透射电镜的主要优点是，它不需要各种病毒特异性的检测试剂。这在致病原不明的病毒大暴发时尤为重要，因为如果致病病毒种类未知，就无法选择针对性的检测试剂和检测手段。如果预计样本中病毒数量较多（>107vp/ml），可以直接用负染法透射电镜进行观察，负染透射电镜技术一直是埃博拉病毒及严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒等新病毒发现和鉴定的重要工具。

但如果预计样本中病毒的滴度较低，病毒样本可以先用蔗糖密度梯度或超离进行浓缩纯化。这2种病毒浓缩方法虽然可以提高检测范围，将病毒的检测下限降至105vp/ml，但它也存在几个局限性，如蔗糖可以破坏一些极不稳定的病毒颗粒，而超离可能将碎片与病毒颗粒一起浓缩导致检测限度下降。负染透射电镜的图片可以直接显示单个病毒颗粒的形态并可以通过计数病毒颗粒数量确定病毒的浓度。然而，由于仪器使用成本高、需要的空间及设施较多，限制了透射电镜分析的推广。

（四）血清学鉴定

用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验或血凝试验可鉴定病毒种、型及亚型。从患者检材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用患者急性期与恢复期双份血清做血清学试验，血清抗体滴度≥4倍以上增高，才具有意义。

四、直接检测病毒核酸或抗原

（一）直接检出病毒核酸

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学的进步，大大提高了病毒病的诊断水平。病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定及抗原和抗体的免疫学检测，进入可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸（DNA或RNA）和蛋白质等的测定，关键在于测定这些分子的特异序列或结构。病毒基因组含有特异序列，可以用核酸杂交的方法予以检出，而这段序列的存在则说明了该病毒的存在。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链反应（PCR）等。其中核酸杂交和PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断中最具应用价值的方法。

1.核酸杂交

临床病毒学中快速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原，然而核酸分子杂交具有高度敏感性和特异性。目前核酸分子杂交不但用来检测急性患者标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢性感染或潜伏感染患者标本中的病毒DNA。

（1）斑点杂交法：
将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32P或131I同位素标记的探针通过放射自显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。

（2）固相杂交技术：
将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加入待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。

（3）原位分子杂交技术：
在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。

（4）Southern印迹和Northern印迹法：
Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA，用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子质量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA特异序列。
Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。

2.聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外基因扩增法，先将待检标本DNA热变性为单股DNA作为模板，加一对人工合成的与模板DNA两端各20个碱基互补的引物，在耐热DNA多聚酶作用下，使4种脱氧核苷按模板3′端引物向5′端延伸DNA链，经20～40个循环，可使1个拷贝的核酸扩增至106以上，经琼脂糖电泳，可见到溴化乙锭染色的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。

定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是在反应过程中，实时对病毒核苷酸进行定量的方法。PCR分析也可以用于病毒RNA的鉴定，只需先将RNA逆转录成DNA，然后再进行PCR分析，这一方法被称之为逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）。PCR是用来检测病毒核苷酸的使用最广的方法之一。此法较核酸杂交敏感、快速，已用于肝炎、HIV、疱疹病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景。

然而，病毒的高突变率会使病毒核酸序列发生剧烈变化，导致跟原来的PCR引物不匹配。依赖核酸序列扩增技术（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）是一种快速且通用的病毒检测方法，敏感度很高，但由于制备NASBA反应混合液难度较高而商品化的试剂盒价格昂贵，该方法目前并没有被广泛应用。除此之外，还有转录介导扩增技术（transcription mediated amplification，TMA）、链替代扩增反应技术（strand displacement amplification，SDA）、环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）、解链酶扩增技术（helicase dependent amplification，HDA）、多重依赖探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等。 其中多重 PCR、HDA、LAMP可以针对多个基因靶点同时检测2种以上的病毒。LAMP与NASBA都是基于病原体核酸的等温扩增技术。逆转录LAMP的检测下限可低至10个拷贝数。多重LAMP可在30分钟内检测多种病毒及其亚型，与普通PCR相比敏感性和特异性都明显升高。

3.基因芯片技术

基因芯片技术是研究基因组学、蛋白质组学的有力工具。芯片技术与宏基因组学方法可提供快速病毒鉴定。在数据库中寻找可用的序列数据设计寡核苷酸探针，使芯片能在临床诊断中识别相应的病毒。这种方法可以有助于发现新的病毒，即使是没有基因恒定区的病毒也可通过测序获得检测结果，测序加上微阵列芯片则又是一种强大的高通量诊断工具。流感病毒芯片FluChip-55 microarray专为快速检测流感病毒A及其各亚型而设计。

蛋白芯片可应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-配体相互作用的研究，能够分析免疫反应，对于诊断和生物标志物的发现都很重要。蛋白芯片还可以作为一种快速、灵敏、简单的工具，用于大规模检测血清中病毒特异性抗体。SARS流行期间，采用冠状病毒蛋白质芯片筛选人血清（>600个血清样本），发现其准确性>90%，且特异性高于ELISA。因此，蛋白芯片是未来病毒感染流行病学研究的一个潜在的强大工具。

4.高通量测序技术

近年来，高通量测序以其多样本、高通量、多功能的特点从根本上彻底改变了基因组学领域，使之前由于技术缺陷而无法进行的试验都能得以开展。高通量测序一直应用于新病毒的发现，许多病毒和菌株用这种方法被鉴别出来，包括2013年新发现的副流感病毒Ⅳ。高通量测序具有令人难以置信的敏感性，它可以同时检测多个患者样本，确定特定病原体和病毒抗性，以确保患者得到适当的治疗。虽然与经典Sanger测序相比，从单个碱基层面上来看高通量测序具有价格优势，但是对于单个反应来说仍显得昂贵，且大多数临床实验室对这项技术还没有足够的需求和认知。此外，样本的制备到数据获得一般需要2～3天，一个反应所产生的大量数据还需要有经验丰富的专业型生物信息学人员进行分析。当然这些限制将来一定能得到完善，最终高通量测序技术将会在呼吸道病毒分子诊断中发挥重要作用。

5.质谱分析技术

质谱（mass spectrometry，MS）可以提供丰富可靠的核酸、蛋白甚至完整的病毒序列信息，已成为病原体分子诊断的另一种选择。MS可以与各种色谱分析、亲和技术及其他分子诊断技术结合应用，可大大提高其检出率。如基于亲和素法，与纳米技术结合，MS可以检测痕量靶向病原体。病原体核酸PCR扩增也可与MS相结合作为替代方法。MS具有同时快速检测多种病毒，甚至是识别蛋白修改位点的优势。现在MS不仅仅用于蛋白质组学分析，在基因组学中的应用更是越来越普遍。现有MS类型多种多样，用于病原体分析的MS类型有基质激光解吸离子化质谱、表面增强激光解吸离子化质谱、生物气溶胶、裂解气相色谱质谱、毛细管电泳质谱、电喷雾质谱及液相色谱质谱等，其中实践运用效力最强的是电喷雾质谱。

（二）直接检测病毒抗原

病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。常用技术包括：免疫荧光技术、酶免疫技术（酶免疫组化和酶免疫吸附），以及其他技术：固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。

1.免疫荧光

免疫荧光（immunofluorescence，IF）可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用于检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。适用于细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。直接免疫荧光技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异性抗体结合，从而间接识别抗原。近年来使用单克隆抗体大大提高了检测的敏感性和准确性。

2.免疫酶法

其原理与应用范围同免疫荧光技术，免疫酶法是用酶（通常是过氧化物酶）取代荧光素标记抗体，酶催化底物形成有色产物，在普通光学显微镜下清晰可见，不需要荧光显微镜，便于推广使用。

3.放射免疫测定法

放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）包括有竞争 RIA和因相RIA 2种方法。竞争RIA是同位素标记的已知抗原与标本中未标记的待检抗原竞争性结合特异性抗体的试验，将形成的复合物分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检抗原的浓度。因相RIA是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入放射性标记的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于测定粪便中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

4.酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的原理基础是通过抗原抗体的酶标记，该法很好地融合了酶反应的敏感度和抗体的特异性。用ELISA法从细胞、组织、器官或体液中检测特定的病毒蛋白比免疫印迹法更加快速。ELISA法正被广泛用于HIV-1、登革热、流感等病毒的实验研究与诊断。ELISA法主要有两大类型：检测抗原的ELISA（检测病毒蛋白），是将特异性抗体与固相载体结合去检测样品中相应的病毒抗原；而抗体检测ELISA是将抗原包被于固相基质表面用以检测样本中的抗体水平。

通常来讲，ELISA技术敏感度很高，可以用于检测含量很低（10-12～10-9mol/L）的蛋白。ELISA是目前检测HIV-1病毒抗体中使用最广的血清学试验之一。ELISA是检测流感病毒抗原十分有用的诊断方法，且明显优于其他传统的病毒检测方法。还有一项研究也证明：ELISA对于甲型流感病毒的快速检测与鉴定，跟传统的方法相比具有明显的优越性。

虽然ELISA比传统的病毒空斑试验或TCID50测定方法要快速，但它的试剂价格昂贵使得检测成本较高，有时还会缺乏商品化的抗体，而自己制备抗体成本过高。另外，由于非特异结合或与非病毒来源的蛋白交叉反应导致的检测背景过高也会影响结果的一致性。

五、检测病毒特异性抗体

患者感染病毒后，通常可以诱发出针对该病毒1种或多种抗原免疫应答，特异性抗体效价升高或出现IgM抗体则具有辅助临床诊断的价值。从患者检材中分离出病毒株，结合临床症状、检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用患者急性期与恢复期双份血清做血清学试验，血清抗体滴度≥4倍以上增高，才具有意义。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验可鉴定病毒的种、型及亚型。

（一）补体结合试验

补体结合试验（complement fixation，CF）分 2个阶段：①抗原与抗体（一个为已知，一个为待检）混合，加入定量补体，若抗原与抗体相对应，则补体被消耗；②在上述混合物中加入溶血素致敏的绵羊红细胞，若补体已与抗原抗体复合物完全结合，没有剩余补体存在，那么绵羊红细胞不会溶血，结果为阳性，说明待检标本中有特异性存在，出现阳性结果时血清标本最高稀释度为抗体的效价。反之为阴性结果。由于补体结合抗体产生早，消失快，适用于诊断病毒近期感染。若发病2～3周后血清中抗体效价升高≥4倍，则具有诊断意义。

（二）中和试验

中和试验（neutralization test，NT）是在活体或活细胞内测定病毒被特异性抗体中和而失去致病力的试验。试验时：①须先测出病毒的半数致死量（LD50）或半数感染量（ID50）；②随即取活病毒与被试血清按不同比例混合，放置1～2小时让其充分中和；③将病毒与血清混合液注入各组动物、鸡胚或组织细胞培养管内培养；④根据动物、鸡胚死亡数或细胞病变的管数，计算出百分比（%），然后再计算这些试验对象中的半数免于死亡或免于致病所需要的最少量血清（或最大量的病毒），就是该血清的中和抗体效价（称为50%终点的中和效价）。诊断病毒性疾病时，须取患者双份血清同时做对比试验，病后血清的中和抗体效价也必须超过病初血清4倍以上，才能确诊。用此法鉴定病毒时，须将病毒分别与免疫血清及正常血清（对照）混合做对比试验，免疫血清比正常血清多中和50～100倍剂量的病毒，才能断定是该病毒。病毒中和抗体的特异性高，持续时间久，以往受显性或隐性感染后，血中可长期存在中和抗体，所以适用于流行病学调查或人群免疫水平研究，但因试验方法繁杂，耗用动物、鸡胚或细胞培养较多，故一般不作常规使用。

（三）血凝抑制试验

某些病毒（流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能凝集红细胞，而抗体与这些病毒结合后却能阻止它们的凝集，若双份血清滴度增高≥4倍以上，也可用于诊断这类病毒感染。血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test，HIT）简便、快速、经济、特异性高，常用于流行病学调查等。

（四）IgM捕捉ELISA

特异性IgM出现于病毒感染的早期或病毒感染的活动期，因此可从急性期患者单份血清中检出特异性IgM，这是病毒感染实验室早期诊断的可靠方法。实验中先用μ链血清包被微培板孔，用以捕捉血清标本中的IgM类抗体，再加入特异性病毒抗原及酶标抗体以证实特异性IgM的存在。现已广泛用于病毒病的早期诊断。在先天性感染中，IgM检测有特殊意义，因IgM不能通过胎盘，新生儿血清中发现抗病毒IgM提示为宫内感染。

（五）其他技术

1.纳米技术

最新的纳米技术为科学研究又开启了新的发展方向和视角。当物质缩小到纳米级别，物质属性发生变化，纳米技术利用这些新的属性与现有技术结合，发挥特殊功能。免疫PCR是ELISA与PCR的结合，广泛应用于多种细菌和病毒的检测。如果活细胞成像具有鉴别、量化细胞内生物分子的能力，那么就会大大有利于疾病的诊断和治疗。然而建立这种病毒检测体系相当困难，尤其是在感染早期阶段。但是随着分子标记技术的问世，追踪活细胞内mRNA已成为可能。以此为基础，金纳米颗粒通过巯醇基与DNA“发卡”结构相连，形成金纳米颗粒寡核苷酸探针。DNA环形部分是目标RNA的互补序列，5′端与金纳米颗粒相连，3′端连接一个荧光基团。当DNA环形部分与靶RNA杂交时，荧光基团离开金纳米颗粒而发出荧光，从而使mRNA成像成为可能。这种“发卡”DNA金纳米颗粒在HEp-2细胞中成功检测到呼吸道合胞病毒mRNA。

2.表面增强拉曼光谱术

拉曼光谱可以避免水分子的干扰，从物质的天然构象进行生物学分析。即使是对细胞中的单个分子，表面增强拉曼光谱术（surface-enhanced raman spectrometry，SERS）都具有高特异性、高敏感性和高精确性，并且以快速无损的形式进行检测。SERS能以DNA、RNA、蛋白及其他有机化合物为检测目标，分析核酸的碱基序列和组成及蛋白或配体等分子间的相互作用，它可以区分DNA和RNA病毒，分析不同样本来源的病毒。

病毒是重症医学患者重要的病原体之一，随着抗病毒药物的广泛应用，越来越多的病毒对抗感染的一线药物产生耐药性，且近年来不断有新发病毒威胁着全人类的健康，而快速、灵敏、特异的检测方法有助于疫情暴发流行的控制和防止药物的滥用。

传统呼吸道检测依赖于免疫荧光和组织分离培养，虽然组织分离培养为“金标准”，但是检测时间需要几天甚至几周，因此其结果很难用于临床治疗的指导。免疫荧光由于其可快速检测，在几个小时内得到结果，现已作为临床常规方法。目前，分子检测技术以其高灵敏、高特异、快速的特点日渐成熟。除了上述介绍的方法外还有测流免疫技术、流式细胞术等多种新兴检测技术正蓬勃发展，检测手段也不再局限于一两种方法，而是多种技术联合应用，发挥各自的特点，如低成本的多重PCR技术或新型核酸扩增技术搭载MS、芯片等高通量平台是目前最具有发展前景的病毒检测方法。以上很多技术都已获得认证，可进入临床试验。高通量测序技术、基因芯片技术等应用前景广阔，目前更多应用于实验室科研探索，需要向低成本、小设备、快速、高通量和全自动一体化的方向发展，以便于推广适应临床需求。

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知识来源
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作者：段军教授，中日友好医院

专家简介
段军，主任医师，医学博士。
院内职务：外科重症医学科（SICU）主任。
院外任职：兼任中国医师协会重症医师分会青年委员；北京医学会重症医学分会青年委员；中国医师协会呼吸医师分会教育工作委员会委员；AHA心肺复苏及心血管急救培训中心BLS主任导师、ACLS主任导师、ACLS-EP导师；中国中医药信息研究会青年医师分会危重症学组组长；中国医药教育学会超声医学专业委员会重症超声分会副主任委员；中国重症超声研究组（CCUSG）工作委员会委员；中国医促会中老年医疗保健分会全国委员；中国心胸血管麻醉学会围术期器官保护分会青年委员；中国心胸血管麻醉学会急救与复苏分会青年委员；《中国医药》、《实用休克杂志》编委；《中国医师杂志》审稿专家。
担任研究生导师情况：北京协和医学院硕士研究生导师。
学习经历：2002年毕业于中南大学湘雅医学院，获临床医学本科学位；2005年毕业于中南大学湘雅医学院，获心血管内科硕士学位；2012年毕业于北京协和医学院，获心血管内科博士学位。2016年在美国哈佛大学附属麻省医学院任访问学者。
工作经历：2005年起，历任中日医院重症医学科住院医师、主治医师、副主任医师。
科研成果：2018年，主持国家自然科学基金面上项目(81774265)：固本止咳中药调控γδT+/Th17细胞分泌的IL17A对PM2.5所致肺损伤的保护机制研究。2015年，主持中日医院青年科技英才计划项目（2015-QNYC-B03）：分泌型Klotho参与可吸入颗粒物（PM2.5）介导的肺动脉高压进展的机制研究。2013年主持中日医院青年课题（2013-QN-08）：可吸入颗粒物对大鼠急性肺损伤后纤维化的影响及小剂量糖皮质激素的干预作用。发明国家实用新型专利（专利号：201420346877.1）：一种医用导引导管。发表论文情况：在The American Journal of Emergency Medicine、中华危重病急救医学、中国医师杂志等医学期刊发表论著二十余篇，参编参译教材及书籍十余部。
教学情况：承担北京大学医学部、北京中医药大学临床教学任务，协助培养研究生3人。
表彰奖励情况：2014年度中日医院优秀医生；2012年度AHA心血管急救培训中心卓越贡献奖；2013-2014年度中日友好医院优秀教师三等奖；2014-2015年度中日友好医院优秀教师三等奖；2015-2016年度中日友好医院优秀教师二等奖；2016-2017年度中日医院优秀教师奖；30年院庆《而立论坛》之青年学术竞赛三等奖。