禹松林:液相色谱串联质谱技术及临床应用
一、液相色谱串联质谱技术简介
液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)是利用色谱的分离技术和质谱的特异性检测技术,确定物质组成及含量的重要技术。作为临床检验领域的新兴技术,具有测定特异性强、灵敏度高,可同时测定多种化合物,并且可弥补目前常规生化免疫方法无法测定的项目,在国外已有较为成熟的应用,其主要组成包括两大块,一部分是液相色谱系统,另一部分是质谱系统。
色谱分离技术是根据待测物中各物质在固定相和流动相间分配系数的差别,对混合物进行分离的物理化学方法。按流动相和固定相的物理状态,色谱系统可分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。目前临床检验领域与质谱联合最为常用的是液相色谱系统。液相色谱系统以液体为流动相,根据其对压力承受能力的不同又分为高压液相色谱以及超高压液相色谱。液相色谱仪主要分为高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。色谱柱是分离系统的核心部件,也是实现待测物分离的最主要部分,进行色谱分离要考虑色谱柱的填料类型、柱内径、柱长度,这些是影响色谱分离效果的主要成分。此外,液相色谱系统的检测器可以是紫外吸收检测器,也可以是荧光检测器、电化学检测器等。而在LC-MS/MS系统中不包含上述检测器,LC-MS/MS系统的检测器在质谱系统部分。
质谱检测技术是一种测量带电粒子质荷比的分析技术。质谱仪主要包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统,根据不同的电离形式离子源又分为电子电离源、化学电离源、电喷雾电离源、大气压化学电离源、大气压光致电离、快原子轰击电离源、基质辅助激光解析电离源以及电感耦合等离子体。质量分析器是质谱仪组成的核心部件,其作用是将带电离子根据其质荷比大小加以分离,以区分各种离子的质量数和丰度。目前用到的质量分析器有四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱质量分析器、离子回旋共振质量分析器、静电场轨道质量分析器、电磁扇形质量分析器等。
不同的质谱仪类型均有其应用上的优缺点以及适用的研究领域,在临床实验室常规检测中,最常使用的是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)、电喷雾电离源或大气压化学电离源电离的三重四极杆质谱仪或离子阱质谱仪(MS/MS),以及电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)。MALDI-TOF主要用于微生物鉴定以及组学分析中,ICP-MS则主要用于无机元素的测定,MS/MS常与液相色谱系统联合(LC-MS/MS)用于需进行准确定量的项目如激素、氨基酸等定量检测。
LC-MS/MS是当代最重要的定性和定量技术之一,其结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和高特异性特点,相比传统的免疫学技术及单纯的色谱技术,在特异性、灵敏度及多组分同时检测上具有明显的优势。LC-MS/MS可应用于复杂基质中多种化合物的分析测定,在遗传代谢病、类固醇激素、营养元素、蛋白质多肽、治疗药物检测方面有不可替代的作用。
二、LC-MS/MS技术在临床的应用
(一)遗传代谢病筛查
1990年美国杜克大学Millington教授等首次将串联质谱技术应用于新生儿遗传代谢病筛查,该技术能够在2~3分钟内对一个样本同时检测几十种化合物,通过对检测数据的组合分析,实现了一次实验检测多种疾病的目的,提高了检测效率,主要针对氨基酸代谢病、有机酸血症、脂肪酸氧化代谢障碍三大类疾病,包括苯丙酮尿症、半乳糖血症、先天性肾上腺皮质增生症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、同型半胱氨酸尿症等。
质谱技术在遗传代谢病筛查方面具有检测通量高、检测准确性高、使用干血片作为检材方便运输保存,目前国内外已广泛采用串联质谱技术进行新生儿遗传代谢病的筛查。
(二)内分泌激素检测
尽管目前免疫方法已可对甲状腺激素、性激素等进行常规检测,但是激素的检测目前在临床领域仍然面临巨大的挑战,一方面许多激素具有相似的化学结构,免疫方法所使用的抗原抗体原理可能会导致交叉干扰,在体内存在的一些异嗜性抗体也会对免疫学方法的检测结果造成干扰;另一方面,大多数激素的浓度很低,有结合及游离形式,因此对方法的灵敏度要求较高,比如游离睾酮、雌二醇等在男性和女性中含量差异很大,需要有较高的灵敏度和较宽的线性范围才能满足临床检测需求。此外,对于某些复杂的疾病,由于代谢通路障碍,影响该通路上多种激素,需同时进行多个激素的检测,比如对先天性肾上腺皮质增生症的诊断,可能需要同时测定17-羟孕酮、11脱氧皮质醇、雄烯二酮、18-羟孕酮等一系列激素,才能够对具体类型准确区分,然而免疫学方法仅能够测定有限的激素。目前的LC-MS/MS技术通过质荷比对各激素进行监测联合色谱的有效分离,特异性很高,可以避免结构相似物以及异嗜性抗体的干扰,多种激素,如 T3、T4、FT3、FT4、雌二醇、睾酮等的参考方法均为LC-MS/MS方法,并且其灵敏度高,可以对女性中的痕量睾酮进行准确检测,以及对男性或者绝经后女性雌二醇的测定。此外,LC-MS/MS可以一次同时测定十几种类固醇激素,高通量实现对先天性肾上腺皮质增生症代谢障碍的鉴别诊断,而目前的嗜铬细胞瘤及副神经节瘤的诊断及鉴别诊断推荐采用测定血或尿中3-甲氧基肾上腺素和3-甲氧基去甲肾上腺素,LC-MS/MS是目前推荐的测定方法。总之,LC-MS/MS技术因其特异性、灵敏性、高通量等因素在内分泌领域正发挥着越来越重要的作用。
(三)营养元素检测
包括维生素、氨基酸及脂肪酸在内的营养元素测定对预防及诊断相关疾病具有重要作用,LC-MS/MS技术在上述项目的检测中也具有广泛的应用。LC-MS/MS可用于脂溶性维生素A、D、E以及水溶性维生素 B1、B2、B6、B9、B12等的测定。且其在25羟基维生素D(25-hydroxyvitamin D,25-OH-D)的测定中比免疫方法优势巨大,免疫方法测定25-OH-D常会受到3-epi差向异构体以及类似物的干扰,且不能够区分测定25-OH-D2和25-OH-D3这两种在体内都可能存在的维生素D形式,而LC-MS/MS方法由于其特异性高,可区分测定 25-OH-D2和 25-OH-D3,不受3-epi异构体影响等优点被广泛应用于临床检测。此外,LC-MS/MS可用于含量极低的维生素D活性产物1,25 二羟维生素 D(1,25-dihydroxyvitamin D,1,25-(OH)2-D)的检测,也可以用于对维生素D其他代谢物如24,25二羟维生素D(24,25-dihydroxy vitamin D,24,25-(OH)2-D)的检测。检测 24,25-(OH)2-D及其与25-OH-D的比例可用于筛查因CYP24A1突变导致的特发性高钙血症。北京协和医院检验科在2018年建立并发表了LC-MS/MS检测24,25-(OH)2-D的方法。LC-MS/MS技术可以同时准确定量数十种氨基酸和脂肪酸,为此类项目相关的临床研究提供了可靠的方法。
(四)蛋白多肽定量
蛋白质定性分析中MALDI-TOF具有巨大优势,但是其定量分析中LC-MS/MS则更胜一筹,目前LC-MS/MS已被用于PSA、甲状腺球蛋白、PTH、胰岛素、HbA1c、α-淀粉样肽、Tau蛋白等多肽或蛋白质的准确定量分析,为传统的免疫学测定方法提供了更为准确特异的选择。
(五)治疗药物监测
LC-MS/MS可以在单次运行中同时定量分析多个化合物,对于一些联合给药如免疫抑制剂、抗病毒药物等,LC-MS/MS技术具有很大吸引力。目前LC-MS/MS在治疗药物监测中几乎囊括了所有的药物如免疫抑制剂、抗病毒药物、抗癫痫药物、抗抑郁药物、抗生素、抗肿瘤药物、抗心律失常药物以及非法滥用药物等。
三、LC-MS/MS应用的优势及局限性分析
LC-MS/MS在临床应用中具有特异性高、灵敏度好、通量高,可同时测定几十种待测物,并且可测定部分目前生化免疫学方法无法测定的项目,因此具有广阔的应用前景。但是目前的LC-MS/MS应用还具有很多局限性:①方法不一致,目前的方法多是自建方法,各个实验室间方法有较大差异;②配套试剂不成熟,多数试剂还停留在实验室自配试剂自建方法的基础上,不利于实验室间结果的一致化;③手工操作较多,尽管已有部分能够进行自动化前处理的系统对样本进行前处理,但是手工操作仍然较多;④仪器较为昂贵,目前多数仪器为进口仪器,价格昂贵;⑤人才缺乏,质谱方法的建立需要的专业技能较高,对操作人员要求高,而目前经过专业系统化培训的人才较少;⑥智能化发展不足,目前LC-MS/MS结果尚无法直接与实验室信息系统(laboratory information system,LIS)传输结果,只能通过文本或者办公软件联合代码进行传输,易出现错误。
四、LC-MS/MS应用及解读的注意事项
尽管LC-MS/MS技术在临床检验领域具有很多优势,但是在其临床结果解读中有诸多需要注意的事项。在结果定量中,需要培训相对专业的人员来判读哪些是目标峰,哪些是干扰峰,对错误的峰的积分会造成错误结果的报告;需要有熟悉待测物与临床疾病结果间关系的检验专家对结果进行解读,对可能错误的结果及时判别。另外,对于新生儿筛查中一次提供几十种上百种检测物需要有专业人士提供综合的结果分析。
五、LC-MS/MS未来的发展及挑战
无可否认的是LC-MS/MS技术在临床检测领域已经展现出强大的优势,凭借其特异性好、灵敏度高、通量高,可检测部分目前临床常规方法无法检测的化合物等特点,其必将在临床检验领域占据一席之地,与现有生化免疫技术长短互补。然而,其还存在着自动化程度低、仪器昂贵,配套试剂不成熟等阻碍其广泛应用的不足之处,但是随着国内外医疗器械生产厂商以及医疗应用机构的广泛重视,目前存在的缺点正在慢慢被解决,未来LC-MS/MS技术无疑会有更为广阔的应用空间。
知识来源
人卫知识数字服务体系
作者:禹松林,中国医学科学院北京协和医院
专家简介
禹松林,副研究员,硕士研究生导师。主持国家自然科学基金青年项目、北京市自然基金面上项目、国家重点研发计划子课题、中央高水平医院临床科研业务费等多项课题,授权国家发明专利4项,以第一或通讯作者在《Clinical Chemistry》《Analytical Chemistry》等发表文章,共计发表中英文文章六十余篇,其中以第一及共同第一作者发表SCI及核心论著四十余篇。
获北京市科技进步二等奖、中国计量测试学会科技进步二等奖、中国分析测试协会科学技术奖特等奖各一项。
国家卫生健康委人口文化发展中心“精准医疗健康科普项目”专家委员会副秘书长;全国卫生产业企业管理协会实验医学(临床质谱)第一届专家委员会常委兼秘书。
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